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20. Jahrhundert...


1902
Henry Siedentopf (1872 - 1940) und Richard Zsigmondy (1865 - 1929)
entwickelten das "Ultramikroskop" (eine Variante des Dunkelfeldmikroskops) zur
Visualisierung von Kolloidteilchen. 1925 erhielt Zsigmondy den ersten Nobelpreis
in der Mikroskopie (Nobelpreis für Chemie) "für den Nachweis der heterogenen
Natur der kolloiden Lösungen und für die dabei angewandten Methoden, die für
die moderne Kolloidchemie grundlegend sind".

1904 August Köhler (1866 - 1948) und Moritz von Rohr (1868 - 1940)
entwickelten das "Ultraviolettmikroskop", das sich durch eine hohe Trans-
mission im UV-Bereich des Lichtes auszeichnete. Sie konnten dies durch
Quarzglas-, Flußspat- und Lithiumfluorid-Linsen umsetzen. Als Licht-
quelle diente eine Cadmiumlampe.

1909 - 1912 entwickelte Felix Jentzsch (1882 - 1946) einen neuartigen
Binokulartubus, der 1913 von der Firma Ernst Leitz mit großem Erfolg
eingeführt und von zahlreichen Firmen kopiert wurde. Er ermöglicht eine
Aufteilung des Lichtes für beide Augen aus einem Objektiv ohne die
numerische Apertur zu reduzieren.

1911 Max Haitinger (1868 - 1946) prägte den Begriff "Fluorochrom".

1911 Carl Friedrich Wilhelm Reichert (1851 - 1922) entwickelte die
"Lumineszenzmikroskopie". Ein wesentlicher Verdienst der Firma
Reichert (Wien) war die konsequente Weiterentwicklung der
Fluoreszenzmikroskopie, die heutzutage nicht mehr aus den Biowissenschaften wegzudenken ist.

1931 Maria Goeppert-Mayer (1906 - 1972) beschrieb erstmals Zweiphotonenprozesse in ihrer Dissertation (Ann. Phys. 9: 273 - 295). 1963 erhielt sie den Nobelpreis für Physik für “ihre Entdeckung der nuklearen Schalenstruktur“. Diese Arbeit stellt die Grundlage für die Zwei- und Multiphotonenmikroskopie dar, die im 20. und 21. Jahrhundert weite Verbreitung fand.

1935 Alexander Jablonski (1898 - 1980) stellte sein Modell zur Erklärung der Fluoreszenz vor. Hiernach besitzt ein Fluorochrom unterschiedliche energetische Formen, so genannte
Singulett-Zustände (S0, S1, S2...).

1938 Hans Boegehold (1876 - 1965) konstruierte den ersten
Planachromaten und den ersten Planapochromaten.

1941 Frits Zernike (1888 - 1966) erfand den Phasen-
kontrast. 1953 erhielt er dafür den Nobelpreis
(Physik) "for his demonstration of the phase
contrast method, especially for his invention
of the phase contrast microscope".

1946 Theodor Förster (1910 - 1974) beschrieb den physikalischen Prozess,
bei dem Energie eines angeregten Fluoreszenzfarbstoffs (Donor-Fluorochrom)
strahlungsfrei auf einen benachbarten (Abstand ca. 1,5 bis 10 nm) zweiten
Fluoreszenzfarbstoff (Akzeptor-Fluorochrom) übertragen wird: FRET (Fluorescence
Resonance Energy Transfer, korrekt: Förster Resonance Energy Transfer). Eine
verwandte Technik stellt der Bioluminescence Resonance Energy Transfer dar
(BRET). Der Begriff Förster-Distanz zwischen Donor und Akzeptor erinnert noch
heute an seine Arbeit (Energiewanderung und Fluoreszenz, Natur-
wissenschaften 33: 166 - 175). Der Dexter-Energietransfer, der auf
Überlappung von Atomorbitalen zurückzuführen ist, tritt bei einem
Abstand unterhalb von 1,5 nm auf und unterscheidet sich somit
von dem durch Förster entdeckten Effekt.

1951 A. K. Parpatt zeigte, daß man den Kontrast des mikroskopischen Bildes mit Hilfe der Video-Technik steigern kann. Allen et al. griffen diese Idee auf und entwickelten gemeinsam mit der Firma Hamamatsu Photonics 1981 den Allen-Video-Enhanced-Contrast-Differential Interference Contrast (R. D. Allen, N. S. Allen, and J. L. Travis: Video-enhanced contrast differential interference contrast (AVEC-DIC) microscopy. A new method capable of analyzing microtubule related motility in the reticulopodial network of Allogromia laticollaris, Cell Motil. 1: 291 - 302) bzw. das Video-Enhanced Polarization-Verfahren (R. D. Allen, J.L. Travis, N.S. Allen, and H. Yilmaz: Video-enhanced polarization (AVEC-POL) microscopy: A new method applied to the detection of birefringence in the motile reticulopodial network of Allogromia laticollaris. Cell Motil. 1: 275 - 292).

1955 Georges Nomarski (1919 - 1997) entwickelte den Differentiellen Interferenz-Kontrast (DIC). Neben Zernikes Phasenkontrast (Frits Zernike, 1888 - 1966) ist diese Methode das heute am häufigsten angewendete mikroskopische Kontrastverfahren bei der Untersuchung lebender, biologischer Proben.

1957 Marvin Minsky löste das erste Patent für konfokale Mikroskopie (USPatent: 3013467). Die Idee der konfokalen Mikroskopie blieb jedoch mehrere Jahrzehnte unberücksichtigt.

1962 S. J. Strickler und R. A. Berg lieferten mit ihrem Artikel "Relationship between absorption intensity and fluorescence lifetime of molecules" (J. Chem. Phys. 37: 814 - 822) einen wichtigen Beitrag zur Entwicklung der FLIM-Technik (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy).

1962 beschrieben Osamu Shimomura et al. in der Qualle Aequorea victoria das Grün Fluoreszierende Protein (GFP, Green Fluorescent Protein), das durch Anregung mit ultraviolettem und blauem Licht eine grüne Fluoreszenz zeigt. Dieses Protein - sowie zahlreiche Varianten - wird 4 Jahrzehnte später der bedeutendsten Fluoreszenzmarker lebender Zellen (O. Shimomura, F. H. Johnson, and Y. Saiga: Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan Aequorea, J. Cell. Comp. Physiol. 59: 223 - 239).

1972 Douglas Magde et al. legten die Grundlage für FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy) - eine Technik, bei der einzelne Moleküle detektiert werden, die durch ein konfokales Volumen diffundieren. Die aufgenommenen Fluktuationen der Fluoreszenz - verursacht durch einzelne oder mehrere Moleküle - werden durch Korrelationsfunktionen analysiert (D. Magde, E. Elson, and W. W. Webb: Thermodynamic Fluctuations in a Reacting System - Measurement by Fluorescence Correlation Spectroscopy, Phys. Rev. Lett. 29: 705 - 708).

1973 Mu-Ming Poo und Richard A. Cone beschrieben die Grundlage für FRAP (Fluorescence Recovery after Photobleaching, M. M. Poo, and R. A. Cone: Lateral diffusion of phodopsin in Necturus rods, Exp. Eye Res. 17: 503 - 514). Diese Technik gehört zu den wichtigsten Methoden bei der Untersuchung zellulärer Transportprozesse. Sie wurde kontinuierlich verfeinert und um weitere Techniken wie z.B. FLIP und FLAP erweitert (Fluorescence Loss In Photobleaching bzw. Fluorescence Localisation After Photobleaching).

1973 beschrieb Dolino die erste direkte Abbildung ferroelektrischer Domönen in TGS (Triglycerinsulfat) mittels Erzeugung der zweiten Harmonischen. Diese Arbeit wird im allgemeinen als Grundlage für die mittlerweile weit verbreitete SHG Mikroskopie angesehen (Second Harmonic Generation, G. Dolino: Direct observation of ferroelectric domains in TGS with second-harmonic light, Appl. Phys. Lett. 22: 123 - 124). In biologischen Proben wird heute die SHG z.B. zur Detektion von Membranpotentialänderungen eingesetzt. Durch eingelagerte Membranfarbstoffe wird bei streifendem Einfall eines Ti:Sa-Laserstrahls eine Frequenzverdopplung erzeugt, dessen Signalstärke vom Membranpotential abhängt.

1975 Robert Hoffman entwickelte ein neues Kontrast-Verfahren, den Hoffman-Modulations-Kontrast (R. Hoffman and L. Gross: The modulation contrast microscope, Nature 254: 586 - 588).

1981 Daniel Axelrod legte mit seinem Artikel “Cell-substrate contacts by total internal reflection fluorescence“ (J. Cell Biol. 89: 141 - 145) die Grundlage der TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflection Microscopy). Bei dieser Form der Mikroskopie wird lediglich eine schmale Schicht über eine evanescente Welle angeregt, die in der Regel deutlich unter 200 nm beträgt. Das exponentiell abnehmende evanescente Feld wird über eine Totalreflexion erzeugt, wozu unterschiedliche optische Komponenten eingesetzt werden: Prismen, Durchlichtkondensoren, Objekträger und Objektive mit extrem hoher numerischer Apertur.

1982 Die Firma Carl Zeiss stellte das erste kommerzielle Laser-Scanning-Mikroskop (LSM) vor. Der Prototyp der ersten Baureihe, ein LSM 44, steht heute im Deutschen Museum in München.

1982 Duncan et al. beschrieben die CARS-Mikroskopie (Coherent Anti Stokes Raman Scattering), die Molekülschwingungen als Kontrastmechanismus verwendet (M. D. Duncan, J. Reintjes, and T. J. Manuccia: Scanning coherent anti-Stokes Raman microscope, Opt. Lett. 7: 350- 352).

1989 Winfried Denk, James P. Strickler und Watt W. Webb reichten ein Patent für die Zwei-Photonen-Mikroskopie ein (TPM, Two-photon laser microscopy, USPatent: 5.034613).

1990 Stefan W. Hell entwickelte die 4Pi-konfokal Fluoreszenzmikroskopie (EUPatent: EP0491289, 1992, Double-confocal scanning microscope). Diese Technik ermöglicht, die Auflösung entlang der Fokusachse um einen Faktor von bis zu 7 im Vergleich mit dem LSM zu erhöhen. Die fluoreszierende Probe befindet sich hierbei zwischen zwei Objektiven. Die Laserpulse interferieren in einem gemeinsamen Fokus mit einem verkleinerten, zentralen Maximum. Die zwangsläufig bei der Interferenz von sphärischen Wellenfronten entstehenden Nebenmaxima (sidelobes, periodic lobes) werden mathematisch entfernt (Übersicht: Bewersdorf, A. Egner, and S. W. Hell: 4Pi Microscopy. In: Handbook of Biological Confocal Microscopy, (Ed.) Pawley, J. Springer, New York (2006): 561 - 570).

1993 Die Gruppe um Stefan W. Hell entwickelte die STED-Mikroskopie (Stimulated Emission Depletion). Hierfür wird über einen Laserstrahl ein kleinstmögliches Areal einer fluoreszierenden Probe angeregt und anschließend über einen zweiten Impuls ein Teil der Fluorochrome in den Grundzustand überführt, was zu einer Verkleinerung des Anregungsareals in XY um einen Faktor von 2,5 und in Z um einen Faktor von 5 führt. Durch die Kombination von STED mit 4Pi im Jahre 2002 (M. Dyba and S. W. Hell: Focal spots of size lambda/23 open up far-field florescence microscopy at 33 nm axial resolution, Phys. Rev. Lett. 88: 163901) wurden Auflösungen entlang der Z-Achse von 30 - 50 nm erzielt (bei einer Wellenlänge von 750 nm). Durch Verwendung von UV-Lasern könnten hier die 20 nm unterschritten werden.

1994 Douglas C. Prasher und Marty Chalfie gelang es, GFP (Green Fluorescent Protein) als Marker für andere Proteine einzusetzen. Diese Fusionsproteine werden von den zu untersuchenden Zellen selbständig hergestellt (Transfektion). Das GFP sowie zahlreiche Varianten entwickeln sich zu den bedeutendsten Fluoreszenzmarker lebender Zellen (M. Chalfie, Y. Tu, G. Euskirchen, W. W. Ward, and D. C. Prasher: Green fluorescent protein as a marker for gene expression, Science 263: 802 - 805).

1997 Olympus meldete ein Objektiv mit einer bislang unerreichten numerischen Apertur von 1,65 zum Patent an (USPatent: 5659425). Dieses apochromatisch korrigierte Objektiv wird hauptsächlich für die Erzeugung evanescenter Wellen in biologischen Proben bei der TIRF-Mikroskopie verwendet (Total Internal Reflection Microscopy). Weitere TIRFM-Objektive mit extrem hoher N.A. dieses Herstellers folgten: 60x/1,45, 100x/1,45, 60x/1,42, 150x/1,45 und 60x/1,49.

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Strahlengang im großen Polarisationsmi-
kroskop von Fuess, Berlin, Abb. aus Weinschenk, E. (1925): Das Polarisations-
mikroskop, Herder, Freiburg, modifiziert).
Zeichengerät nach Abbe (gebaut von Zeiss, Jena, Abb. aus Weinschenk, E. (1925): Das Polarisationsmikroskop, Herder, Freiburg, 5. Aufl., modifiziert).